2018-12-17
qPCR数据分析包括相对定量和绝对定量,实验室常用相对定量。绝对定量通过已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线,利用Log(起始浓度)与循环数的线性关系,计算样品中模板量,需确定目的基因、标准样本、重复反应孔、标记方法等,以染料法为例,要制备质粒标准品并进行拷贝数计算和梯度稀释,实验中用启衡星SYBR Green qPCR Mix等试剂,进行引物设计、DNA提取、PCR扩增和结果分析,计算得出样品中基因的copy数。相对定量比较样本间基因表达量差异,需参照样本、未知样本、目的基因、管家基因等,常用方法有双标准曲线法和2-△△Ct法,双标准曲线法数据准确但需每轮做标准曲线,2-△△Ct法流程简单但假设扩增效率为100%,实际操作中推荐做标准曲线校正结果,修正公式为E-△△Ct。