产品介绍
本试剂盒是适用于 llumina 平台的新生 RNA 转录组文库构建试剂盒，操作简单，建库时间短，效果稳定，适用于活体动物、植物、活细胞等多种类样本的新生 RNA 文库构建。本试剂盒使用5-乙炔基尿嘧（5- ethynyluridine，EU）标记活细胞中的新生 RNA，然后通过点击化学反应（Click Chemistry），使新生的 RNA标记上生物素，再通过链霉亲和素磁珠特异性捕获新生的 RNA，最后对新生的 RNA 进行文库构建。结合实验时间设计，能够对新生成的 RNA 进行定量分析，同时能够研究 RNA 转录水平和降解问题。
产品特点
储存条件：试剂盒 1 ：2~8℃存储，冰袋运输；
试剂盒 2 、试剂盒 3 ：-25~ -15℃保存，≤ 0℃运输。
注意事项：
实验过程中，请穿实验服并佩戴口罩和一次性手套，在洁净实验区域内操作，同时注意使用无 RNA 酶的耗材；试剂盒使用前需完全解冻并混匀后使用，待用期间请将试剂放于冰上；
本产品仅作科研用。
材料准备（试剂盒中不提供）：
操作步骤：1.1 细胞样本EU孵育
细胞密度在 70-90%或细胞密度达到实验设计的需求，进行 EU 孵育。一般情况下，进行新生转录本捕获的细胞量，建议不低于 1×10⁶；
使用完全培养基稀释 EU，并用稀释后达到合适 EU 浓度的完全培养基培养细胞（常见细胞 EU 的使用终浓度为 1 mM），孵育 2 小时。针对不同细胞及不同的实验目的，建议参考相关文献报道，调整合适的EU 终浓度以及孵育时间；
初次实验时，可按照推荐 EU 剂量和时间进行预实验；如 T25 瓶的细胞将其培养基去除后，将配置好的含有 1 mM EU 的培养基加入到培养瓶中孵育2 小时* 。在培养结束后，按照步骤 2 进行后续实验。
下表为推荐测试的 EU 剂量和时间：
1.2 动物组织EU孵育
根据动物体体重进行注射或灌胃，可以按照200-400 mg/kg的用量，把EU用PBS配制成一定浓度，进行注射或灌胃。具体用量与所用动物的种类、体重以及使用方式有关，可以参考相关文献，如初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用200 mg/kg的浓度进行测试，4小时后*或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织。按照1中步骤2进行后续实验。
*实验验证过小鼠、大鼠、黄鼠、兔子等常见动物模型。
1.3 植物样本EU孵育
根据植物体的培养环境进行添加EU进行孵育，用量可以参考相关文献进行，对于液培可以在培养基中加入EU使其终浓度为0.5 mM，培养6-8小时*，可根据自己方法提取RNA，提取完RNA后，进行第2步点击反应后续实验。
*实验验证过水培和土培的人参、多种花卉和粮食作物等。
2.1 对于培养的细胞样本，去掉培养基，用1 ml Trizol将细胞裂解，置于无酶EP管中，室温静置5 min；对于植物以及动物样本，取到相应组织后，用无酶PBS清洗组织2-3次，将其置于1 mL Trizol中使用研磨仪器研磨直至看不到组织块，置于无酶EP管中，室温静置5 min；
2.2 加入200 μL氯仿，涡旋混匀，室温静置3 min；
2.3 14000g 离心5 min，取上清，加入等体积异丙醇，涡旋混匀；
2.4 冰上静置10 min，14000g离心20 min，弃上清；
2.5 用75%的乙醇清洗沉淀，14000g离心5 min；
2.6 重复步骤2.5；
2.7 弃上清，待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。
备注：使用Trizol或RNA提取试剂盒均可，具体的RNA提取步骤请参照所使用试剂的操作说明书。
2.8 rRNA去除（根据实验需求选做），推荐启衡星核糖体RNA去除试剂盒进行rRNA的去除（这一步为推荐选项，rRNA去除可以提高目标RNA的检测灵敏度以及减少测序量）。3.1 点击反应液配制；
3.2 每个样本中加入150 μL点击反应液，涡旋混匀；
3.3 冰上静置30 min；
3.4 向点击反应液中加入1 ml Trizol，涡旋混匀；
3.5 重复第2步中2.2-2.6步骤的Trizol法RNA提取过程，弃上清后待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。
备注：
4.1 涡旋振荡使链霉亲和素磁珠充分悬浮，不要离心，以防磁珠沉降；
4.2 每个样品取20 μL重悬好的磁珠到一个新的EP管中。对于多个样品所需SMB磁珠的清洗，可一起进行，如将6 个(120 μL)或12个样品(240 μL)的磁珠分装在一个管中进行清洗。每20 μL链霉亲和素磁珠加入20 μL的2×Wash Buffer混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；
备注：
4.3 取下装有磁珠的EP管后，每20 μL链霉亲和素磁珠加入40 μL的2×Wash Buffer混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；
4.4 取下装有磁珠的离心管，每20 μL链霉亲和素磁珠加入40 μL溶液A，混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；
4.5 重复4.4步骤；
4.6 取下装有磁珠的离心管，每20 μL链霉亲和素磁珠加入40 μL溶液B，混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；
4.7 重复4.6步骤；
4.8取下装有磁珠的离心管，每20 μL链霉亲和素磁珠中加入50 μL 2×Wash Buffer重悬。
5.1向第3步中得到的RNA，每个样本加入50 μL准备好的链霉亲和素磁珠；
5.2涡旋混匀后，室温孵育20 min，将EP管置于磁力架中2-3 min，待磁珠吸附完成后，弃上清；
5.3每个样本加入20 μL 的1×Wash Buffer，混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；再重复2次。
5.4 此时新生RNA已经被链霉亲和素磁珠捕获，此时捕获的新生RNA可以用于下游的应用，如RT-qPCR，RNA-seq等。6.1 将样品重新放回至磁力架中，室温静置 5 min，吸掉全部上清。
【注】：最后需要用 10 μL 移液器吸干净残留液体。
6.2 将样品从磁力架上取出，用 18 μL Frag/Prime Buffer 重悬磁珠，用移液器吹打 6 次以彻底混匀；将样品置于 PCR 仪中（预设为 94°C），94°C，7 min；
6.3 将磁珠连同反应液进行第一链合成。7.1 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按下表所示，配制第一链cDNA合成的反应液；
7.2 使用移液器轻轻吹打或涡旋混匀，瞬离将反应液离心至管底；
7.3 将上述 PCR 管置于 PCR 仪中，按照下表所示设置反应程序，进行第一链 cDNA 的合成。反应结束后立即进行第二链 cDNA 的合成。
8.1 将第二链合成试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀；按照下表所示，配制第二链 cDNA 合成/末端修复/加 A 反应液；
8.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底；
8.3 将上述 PCR 管置于 PCR 仪中，按照下表所示设置反应程序，进行第二链 cDNA 的合成。
该步骤可在末端修复和 dA 尾添加的产物末端，连接特定的 Illumina ®接头。将下表中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
9.1 于上述步骤结束后的 PCR 管中继续配制下表所示反应体系；
9.2 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
9.3 将 PCR 管置于 PCR 仪中，设置下表所示反应程序，进行接头连接反应。
10.1 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀；
10.2 在上述 100 μL 的连接体系中加入第一轮分选磁珠 20 μL (0.20 ×)，涡旋或移液吹打 10 次混匀。室温孵育10 min；
10.3 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约 5 min），小心转移上清到干净的离心管中；
10.4 向上清中加入第二轮分选磁珠 0.1×（120 μL × 0.1=12 μL）；
10.5 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置10 min；
10.6 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约 3 min），小心移除上清；
10.7 保持 PCR 管始终处于磁力架中，加入200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec，小心移除上清；
10.8 重复步骤 7；
10.9 保持 PCR 管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约 3 min）；
10.10 将 PCR 管从磁力架中取出，加入 21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置 5 min；
10.11 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约 3 min），小心转移 20 μL 上清至干净管中。
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行 PCR 扩增富集。
11.1 将下表中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用；
11.2 于无菌 PCR 管中配制下表所示反应体系；
11.3 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
11.4 将 PCR管置于PCR仪中，设置下表示反应程序，进行 PCR 扩增。
12.1 准备工作：将 StarPure DNA Size Selection Kit-V2由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min，同时配制 80%乙醇；
12.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀；
12.3 吸取 45 μL Beads (0.9×，Beads : DNA=0.9:1)至 Adapter Ligation 产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育 5 min；
12.4 将EP管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清；
12.5 保持EP管始终置于磁力架中，加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清；
12.6 重复步骤 5，总计漂洗两次；
12.7 保持EP管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过 5 min）；
12.8 将EP管从磁力架中取出，加入 21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。将EP管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约 3 min）；
12.9 小心移取 20 μL 上清至新EP管中，进行文库定量、质检。
常见问答：
1、STAR-Click新生转录本捕获试剂盒的三个规格12T、24T、96T是怎么定义的？
答：规格确定均相对于T25培养瓶而言。
2、STAR-Click新生转录本捕获试剂盒捕获的新生转录本有时效期吗？比如多长时间内可以产生新生转录本？
答：看实验目的。如果需要短时转录，可以加大EU浓度，缩短反应时间，如10 min。
3、STAR-Click新生转录本捕获可以做多个刺激时间点，然后看新生转录本的合成速率与降解速率吗？
答：可以的。
合成速率：以细胞样本为例，以含有适宜EU浓度的培养基培养细胞，监测多个时间点的新生转录本的变化，进而对合成速率进行研究；
降解速率：以细胞样本为例，先以含有适宜EU浓度的培养基培养细胞一定时间（根据实验需求而定），之后置换为不含EU的培养基对细胞进行培养，之后监测多个时间点的新生转录本变化情况，进而对降解速率进行研究。
4、EU孵育后的细胞样本，若暂时没时间做后续实验，可以将细胞沉淀加Trizol后冻存吗？
答：可以的。加Trizol后的细胞样本，可以在-80℃保存较长时间。但是为了避免RNA降解等可能影响实验的因素，建议尽早完成后续实验。
此外，若因实验过程中细胞样本生长不同步，也可在EU孵育后，将细胞加Trizol后先冻存起来，最后再一起进行后续实验。
5、要通过qPCR检测具体某个基因的新生转录本情况，内参怎么选择？
答：常规内参即可，没有特殊要求。
6、在RT-qPCR的应用中，最后一个步骤得到的RNA还带着磁珠，需要将RNA洗脱下来吗？带着磁珠进行反转录，会影响下游的应用吗？
答：不需要洗脱，先带着磁珠进行反转录，然后取上清进行qPCR。在实验过程中，可以提前配制反转录体系，用配置好的反转录体系重悬5.3步骤完成后的磁珠，直接进行反转录过程。在反转录第一链合成后，加热至98℃（5 min）后，立马将其置于磁力架上（1-3 min，至溶液澄清），以防止恢复到室温后两条链再次配对。后取上清，进行后续qPCR实验。需要注意，不能以带着磁珠的溶液进行qPCR，因为磁珠会影响qPCR仪的检测。
此外，若反转录后已恢复至室温，但还没有及时进行上清液的分离，可尝试98℃再次加热（如5 min），以尽量防止两条链的再次配对，获得更多的cDNA。
7、5.3步骤完成后的磁珠需要用什么试剂进行溶解？
答：看后续实验要求，无酶水、Wash Buffer、配置好的反转录体系等均可。
8、对于用磁珠捕获的新生转录本，无法检测RNA的浓度，怎么确定反转录时的RNA样本量呢？
答：可以对点击反应后的RNA（第3.5步骤）进行浓度检测，在完成新生转录本捕获后，以点击反应后RNA测定浓度的10-15%为RNA样本量进行后续反转录实验。考虑到实验过程中的不确定，可以适当加大反转录体系的剂量，以保证反转录反应的有效进行。
9、对于RNA-seq实验，需要去除核糖体RNA吗？
答：为提高目标RNA的检测灵敏度以及减少测序量，推荐在点击反应之前增加核糖体RNA去除步骤（推荐试剂：启衡星核糖体RNA去除系列试剂盒）。
